科研 | 广州中医药大学：基于网络药理学/代谢组学探究参芪扶正注射液调节癌症相关疲劳的作用机制（国人佳作）
编译：微科盟草重木雪，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。
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中草药具有多种靶点和特性，在多学科癌症治疗中的应用受到越来越多的关注。本文研究了参芪扶正注射液(SFI)中可能调节癌症相关疲劳(CRF)的活性成分。首先我们采用体外细胞模型检测SFI对CRF的调节作用，后通过代谢组学分析确定SFI处理C2C12小鼠成肌细胞中潜在的基因和通路，并通过网络药理学和分子对接分析预测化合物与CRF靶点的相互作用。免疫印迹法进一步验证了推测的途径。结果表明，SFI能显著抑制肌细胞凋亡，提高肌细胞线粒体膜电位。网络药理学分析结果鉴定出36个候选化合物，其中SFI获得244个潜在靶点，其中10个关键靶点与癌症相关疲劳有关。富集分析和实验验证表明，SFI可能通过激活AMPK和抑制PI3K/Akt信号通路来改善肌细胞线粒体功能，并触发线粒体代谢酶MnSOD和凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达变化。我们发现SFI在抗肿瘤相关疲劳中的作用和机制至少部分是由于其靶向AMPK和PI3K/Akt信号通路，该研究展现了网络药理学在中药研究中新的应用前景。
论文ID
原名：Network Pharmacology/Metabolomics-Based Validation of AMPK and PI3K/AKT Signaling Pathway as a Central Role of Shengqi Fuzheng Injection Regulation of Mitochondrial Dysfunction in Cancer-Related Fatigue译名：基于网络药理学/代谢组学的AMPK和PI3K/AKT信号通路在参芪扶正注射液调节癌症相关疲劳线粒体功能障碍中的中心作用验证
期刊：Oxidative Medicine and Cellular Longevity
IF：6.543发表时间：2021.07通讯作者：林丽珠
通讯作者单位：广州中医药大学第一附属医院
实验设计
实验结果
虽然SFI常被用于临床癌症治疗的一种辅助疗法，目前还没有足够的证据阐明它的机制。为了系统研究SFI对CRF的作用，我们引入了小鼠疲劳模型，通过皮下注射CT-26细胞株小鼠，然后进行了一系列行为实验，如图1(a)所示。这是一个适合研究SF1对CRF影响的临床前模型。体内实验发现，在整个实验期间，SFI对减小的肿瘤体积几乎没有影响（图 1（e）），并且在SFI处理后肿瘤重量没有减少（图 1（d））。H&E染色和Ki67检测均显示SFI对肿瘤组织无明显影响(图1(b)和1(c))。这些结果表明，SFI不能抑制肿瘤的生长。如图1(i)所示，在整个实验周期内，肿瘤小鼠(模型组)的负重游泳次数均有低于正常小鼠的趋势，并在21天后显著下降。而同时接受不同剂量SFI的小鼠在第14天和第17天游泳时间显著改善。实验结束时，旷场测试(图1(f))、总距离(图1(g))和移动时的速度(图1(h))表明，当小鼠有肿瘤时，自主活动显著降低，但SFL治疗改善了自主活动。此外，肿瘤小鼠腓肠肌的H&E染色显示其横截面积略有减少，但SFI处理显著增加了肌肉面积(图1(j))。模型组线粒体超微结构观察到类似现象(图1(k))，梗死周围区大部分线粒体出现明显紊乱，包括异常嵴或基质区域。部分线粒体嵴和基质被移除，形成空泡，部分线粒体肿胀，肌浆网扩张，嵴紊乱和断裂；SFI治疗组线粒体超微结构形态紊乱改善。结果表明，SFI改善了肿瘤小鼠的自主神经活动和线粒体的肌肉含量，因此，SFI是一种潜在的体内治疗CRF的辅助药物。
(a)动物研究示意图；(b)表征组的H&E染色和免疫组化检测Ki67；(c)各组量化的Ki67结果；(d)干预过程中小鼠肿瘤体积和(e)试验结束时肿瘤重量(n = 4只小鼠，共16个腺体)。为了研究SFI是否改善肿瘤引起的疲劳症状，检测每组与自主活动有关的(f)旷场试验，(g)总距离和(h)移动速度。(i)在整个干预过程中小鼠负重游泳。(j) H&E染色和(k) TEM检测腓肠肌线粒体（n = 4 只小鼠，总共 20 个腺体，*P < 0:05，**P < 0.01，****P <0.0001与对照；#P < 0.05，##P <0.01,####P < 0.0001与模型）。 2. SFI恢复了C2C12小鼠肌管中癌症相关疲劳诱导的线粒体功能障碍
线粒体作为机体重要的能量工厂，可通过一系列的电子传递活动影响细胞的生长、代谢、凋亡、坏死等细胞过程。为了研究小鼠结肠癌细胞(CT-26)对骨骼肌细胞凋亡和坏死程度的影响，我们检测了C2C12肌管在CT-26培养液中6 h、12h、24h和H2O2培养液中2h的凋亡情况。如图2(a)所示，CT-26培养基对C2C12小鼠肌管损伤具有时间依赖性；6h、12h和24h总凋亡率分别约为11.2%、23.4%和17.9%，H2O2处理2h总凋亡率为19.1%。时间点根据12 h后细胞凋亡事件总数设置。恶性肿瘤微环境损伤C2C12小鼠肌管12h后，分别给药5mg/mL、10mg/mL和20mg/mL的SFI，凋亡细胞的比例分别降至约15.3%、11.6%和10.8%。根据流式细胞术结果，SFI降低C2C12小鼠肌管肿瘤诱导凋亡的最佳作用浓度为10 mg/mL。线粒体膜电位(ΔΨCm)的变化指示细胞凋亡，ΔΨCm 的消散直接表明线粒体膜被破坏。此外，使用荧光探针JC-1(图2(b))可以测量SFI对ΔΨCm的影响，结果表明，在CT-26或H2O2条件下，C2C12肌管中JC-1红色荧光与绿色荧光的比例显著降低，说明恶性微环境导致ΔΨCm的消散。然而，SFI治疗可显著防止C2C12肌管中ΔΨCm的癌致消散。此外，线粒体电子传递链(ETC)在其活动过程中产生活性氧(ROS)，是骨骼肌氧化剂的最大来源。为了验证我们的假设，即SFI处理会改变ROS水平，我们通过测量DCFH-DA荧光来检测胞质氧化活性(图2(c))，数据表明，SFI处理导致ROS增加，但细胞内ROS水平不显著。我们继续通过western blot检测Mn-SOD蛋白来验证SFI的线粒体氧化活性(图2(d))，这些发现证实了SFI增强了癌症相关疲劳诱导的C2C12小鼠肌管中线粒体功能障碍。
(a)不同时间点和SFI剂量的代表性凋亡分析，用CT-26培养6、12、24 h以及 H2O2培养2 h诱导C2C12小鼠成肌细胞。CT-26培养基刺激12 h后，分别给予5、10和20 mg/mL三种不同剂量的SFI （*P < 0:05 vs. control，****P < 0:0001 vs. NC，值表示为平均值±SD，n = 3）(b) SFI显著增强JC-1线粒体膜(P <0.0001 vs. CT-26培养基;值表示为SD平均值，n = 3)和(c) 6 h孵育后细胞内ROS增强。(d) western blotting分析提示处理后Mn-SOD2的表达。蛋白密度测量数据用β-肌动蛋白归一化。 3.代谢组学分析确定了SFI调控CT-26细胞损伤C2C12小鼠肌管分化的可能代谢靶点
为了进一步理解SFI对C2C12小鼠ct -26诱导线粒体功能障碍的修复机制，我们对有无CT-26损伤和SFI处理的C2C12细胞株进行代谢组学分析。在正离子和负离子模式下获得了细胞样品的代谢谱，样品的代表性基峰强度(BPI)色谱图见补充表2，从细胞标本中检测到366个代谢物。而从PCA评分图(图3(a))可以看出，对照组与CT-26组(模型组)分离良好。与SFI和模型加SFI相比，它们逐渐接近于空白组。四组PLS-DA模型参数分别为:R2X = 0:479, R2Y = 0:991, Q2Y = 0:917，表明PLS-DA模型具有良好的稳定性和可预测性(图3(b))，总之，几种代谢物在各组之间显示出相当大的差异。我们选择 VIP>1并与t检验计算结果中P<0:05 的离子结合作为下一个待鉴定的差异代谢物，基于Q-TOF平台提供的准确质量，结合HMDB、METLIN和MoNA数据库，通过MS/MS片段信息对代谢产物进行初步鉴定和验证。然后，我们确定了 40 个潜在的生物标志物（图3（d），表 S4），并使用相同水平的Z分数确定了不同组中代谢物的相对含量（图3（c））。同时，我们利用Heml软件将40种潜在代谢物在4组间的分布情况用热图显示出来(图3(e))，而聚类分析显示了潜在生物代谢物之间标记相对含量的变化。为了探索SFI抗CRF的机制，将鉴定的代谢物引入代谢分析系统，构建代谢途径，获得了28条通路（图3（f）），图3（g）探索了基因-代谢物-通路之间的关系，并将11种潜在代谢物扩展到相邻的108个基因（补充图S1-S11)。
(a, b)负离子模式下的PCA和PLS-DA分析。不同的颜色代表不同的组(红色代表控制，黄色代表CT-26 + SFI，蓝色代表SFI，绿色代表CT-26，这也适用于(c, e)中的颜色)。(c)代谢物Z-score图。(d)维恩图显示不同组代谢物的数量和多样性，所有组共有40种代谢物。(e) 40种差异代谢物的热图分析，变化程度用不同颜色标出;每一行代表一个样本，每一列代表一个代谢物。(f)潜在生物标志物的代谢途径分析。(g)基于途径分析的基因的潜在代谢物网络，红色代表途径，黄色代表代谢物，蓝色代表相关基因。
4. SFI的候选成分
黄芪(HQ)和党参(DC)是组成SFI的2个药材。我们通过TCMSP数据库共获得619个化合物，其中HQ中有191个化合物，DC中有428个化合物。为了确定SFI的化合物靶标网络，我们对每一种草的OB≥ 30%， DL≥ 0.18，Caco-2>0筛选候选化合物，共得到36个候选化合物(补充表1)。
5. SFI的化合物-靶点-癌症相关疲劳网络
在上述化合物中，我们鉴定出了与SFI中化合物对应的393个分子靶标。从Genecard中提取到3839个基因与CRF杂交，其中244个与分子靶标重叠(图4(a))。随后，化合物目标网络如图4(b)和图4(c)所示，表明了不同化合物和目标之间存在复杂的相关性。为了探讨SFI治疗CRF的潜在药理作用，我们构建了两个PPI网络，包括SFI复合靶点的PPI网络和SFI复合靶点的CRF靶点。我们将244个目标导入STRING数据库以生成PPI结果（设置：人源以及置信度>0.7、高>0.7、中>0.4和低> 0.15），然后使用Cytoscape和clustermaker插件来创建布局网络。如图4(d)所示，共构建322个节点，1599条边，平均节点度为8，网络直径为8，平均邻居数为9.932个。10个程度最大的靶点分别为APP(55度)、MAPK1(50度)、JUN(45度)、AKT(38度)、ANXA1(37度)、MAPK14(33度)、TP53(37度)、RELA(36度)、PRKACA(34度)、HSP90AA1(34度)。这些靶点可能在CRF的调控中发挥关键作用。为了进一步分析SFI作用于CRF疾病的机制，我们将SFI复合靶标与Cytoscape插件MCODE过滤的CRF靶标连接，构建SFI复合靶标与CRF的PPI网络，如图4(e)所示。
(a) CRF调控基因和SFI可能的分子靶点的维恩分析。有244个CRF靶向基因受SFI调控。(b, c)化合物靶标网络说明了SFI和CRF靶向基因的活性成分之间的相互作用。蓝色代表SFI的化合物，黄色列出CRF基因的靶标。(d) SFI复合目标的PPI网络，不同颜色代表程度，如尺度所示。圆的大小也表示度数。(e)针对CRF的SFI化合物靶标的PPI网络，从STRING数据库生成的原始PPI数据显示了靶标的详细交互作用。 6. SFI功能富集分析
我们继续使用GO和功能富集分析来识别所有人类基因背景下的候选靶点。GO将功能分为分子功能(图5(a))和生物过程(图5(b))两类。细胞成分类别中的富集是RNA聚合酶II启动子转录的正调节(GO:0045944)、信号转导 (GO:0007165)、药物反应 (GO:0042493)、凋亡过程的负调节 (GO:0043066) ), 转录的正调控, DNA 模板 (GO:0045893), 细胞增殖的正调控 (GO:0008284), RNA 聚合酶 II 启动子转录的负调控 (GO:0000122), 细胞凋亡过程 (GO:0006915), 氧化还原过程 (GO:0055114)、炎症反应 (GO:0006954)、基因表达的正调控 (GO:0010628)、细胞增殖的负调控 (GO:0008285)、对缺氧的反应 (GO:0001666)，以及 G 蛋白偶联受体信号通路 (GO:0007186)。此外，KEGG 分析表明，这些基因富集在代谢途径、癌症途径、PI3K/Akt信号通路、癌症中的microRNA、神经活性配体-受体相互作用、内吞作用、HTLV-I感染、细胞因子-细胞因子受体相互作用和AMPK信号通路（图5（c））。筛选出hub基因的通路网络如图5(d)所示;方格表示参与网络的通路和目标基因是由圆圈决定的。
(a)分子功能；(b)生物过程；(c)途径富集分析。颜色代表调整后的不同P值<0.05，而圆圈的大小代表计数。(d)基因靶途径信号网络。灰色椭圆表示不同的基因靶点，正方形颜色表示路径。 7. SFI通过AMPK和PI3K/Akt通路增加C2C12肌管线粒体生物发生
我们发现AMPK途径是SFI参与改善被恶性肿瘤微环境破坏的小鼠肌管能量代谢的主要途径。代谢组学结果如图6(a)所示，左图为AMPK信号通路；红色矩形节点代表最引人注目的SFI药理作用相关的基因，我们检查了这些蛋白质含量，结果表明,CT-26细胞中可以明显抑制p-AMPK，p-CREB，C1C12老鼠肌小管细胞和Sirt-1基因表达，并且与H2O2有同样的伤害效果,但它们对AMPK-α和CREB总量没有影响(图7(a))。此外，我们发现AMPK途径激活了一个Foxo3磷酸化位点。经过CT-26细胞培养基处理后，SFI刺激了Foxo3在Ser413和Ser253位点的磷酸化(图7(b))，然后增加了细胞核中PCG-1α的蛋白水平(图7(a))，并进一步增加了线粒体中MnSOD的表达(图2(d))。之前的研究发现AKT活性被FoxO3a在Ser253位点的磷酸化抑制。然而，这些实验的结果显示了Foxo3a在Ser523和Ser413位点磷酸化的表达结果相反(图7(b))。如图6(b)所示，右图为PI3K/Akt信号通路，蓝色矩形节点与SFI药理作用相关;我们检测了PI3K和AKT蛋白的表达水平，SFI处理后，p-PI3K、p-AKT和Bax降低，bcl-2升高(图7(c))， SFI对保护性线粒体的作用机制也通过PI3K/AKT途径发生。如上所述，SFI对癌相关疲劳C2C12小鼠肌管线粒体生物发生的影响是通过与参与AMPK通路的线粒体相关的代谢物，以及细胞凋亡调节的PI3K/Akt通路(图8)。
(a) KEGG通路提示AMPK信号通路中与SFI药理作用密切相关的多种靶点红色矩形节点代表与SFI药理作用相关的最重要的基因或生物通路。(b) KEGG通路提示PI3K/AKT信号通路中与SFI药理作用密切相关的多种靶点。蓝色矩形节点代表与SFI药理作用相关的最重要的基因或生物途径。
(a) AMPK信号通路的蛋白表达；(b) Foxo3a、Ser 413和Ser 253磷酸位点的蛋白表达；(c) PI3K/Akt信号通路的蛋白表达。蛋白密度测量数据与β-actin归一化，p-AMPK-α、p-CREB、p-AKT、pPI3K、p-Foxo3a Ser413和Ser253与AMPK-α、CREB、AKT、PI3K和Foxo3a蛋白含量归一化。
我们目前关于SFI保护小鼠在癌症相关疲劳中肌管损伤机制的假设的总结。SFI的保护作用可能与AMPK的激活和PI3K/AKT信号通路的抑制有关。 8. SFI与CRF基因靶点的分子对接
为了探讨SFI参与信号通路的证据，我们利用分子对接分析鉴定候选靶标，正、负分组条形图显示所有SFI化合物均与候选靶标相关(图9(a))。其中评分最高的蛋白为AMPK、SIRT1、Akt1、NOS2和RXRA(图9(b)-9(f))，与western blot结果高度相似。我们发现菊花黄质可以与这五种蛋白结合，其复合结合效价蛋白比值如图9(g)所示。此外，菊黄素与AMPK、SIRT1和Akt1蛋白的结合效果最强(△G：-7.5、-7.1和-8.39 kcal/mol)(图9(h)；补充表3)。这表明，菊黄质可能是SFI通过AMPK和PI3K/AKT途径抗CRF作用的中心分子。
(a)正、负分组条形图显示了与CRF候选靶标相关的所有SFI化合物。(b f)对接SFI得分最高的蛋白质。(g)菊黄素与这些目标蛋白的对接率。(h)分别在AMPK-α、AKT和SIRT-1蛋白中结合菊黄质配体的口袋。
讨论
正在接受治疗和/或疾病进展的恶性肿瘤患者也会遭受与癌症相关的疲劳，目前对CRF的治疗策略了解甚少，一些药物治疗和基于运动干预的优点相对有限。尽管CRF的病因研究已近20年，但迄今为止还没有大规模、随机、双盲的临床试验来确定干预方法的有效性。经验记录显示，用于治疗CRF的传统草药含有一系列化合物，可能成为药物发现的潜在先导。SFI是由黄芪(HQ)和党参(DC)两种中药组成的经验方，在中国已被广泛用于缓解CRF症状。循证医学已证明SFI对缓解CRF的积极疗效;然而，其机制尚不清楚。我们之前的研究证实，SFI改善恶病质小鼠模型中的疲劳样行为，完全或者主要是通过其对骨骼肌的作用。在本研究中，我们结合网络药理学、分子对接分析和生物学验证，在SFI中发现了几种能够靶向成肌细胞蛋白从而调控线粒体功能的化合物。
CRF的一个主要特征是骨骼肌和线粒体功能障碍。CRF的能量代谢紊乱主要是由线粒体功能障碍和骨骼肌细胞凋亡引起的，而线粒体功能障碍和骨骼肌细胞凋亡是由能量产生障碍或ATP纵向消耗引起的。与CRF能量代谢紊乱相关的线粒体异常包括线粒体膜完整性丧失、转位蛋白氧化腐败、肌肉线粒体形态异常和有氧代谢缺陷，或两者兼有。我们的结果表明，CT-26细胞培养基以时间和剂量依赖性的方式改变了C2C12肌管的凋亡活性，这可能与线粒体功能障碍有关。我们发现肿瘤介质抑制了线粒体运输链(ETC)电子转移的活性，我们发现癌症培养基抑制了线粒体转运链 (ETC) 的电子转移活动，促进了线粒体膜电位 (ΔΨCm)的消散，并增加了小鼠肌管细胞中ROS的产生。然而，这些变化可以通过补充SFI来改善。SFI可调节结肠癌小鼠腓肠肌线粒体功能，增加ATP产量，与文献一致。这些发现可能有助于解释SFI中的某些化合物如何作为线粒体保护剂参与CRF的能量代谢。
我们的传统观点已经从“一种药物，一个靶点”模型转变为“药物-靶点网络”模型，网络药理学是一种高效的研究策略，进一步反映了关键靶点以及药物与疾病之间的复杂关联。一些中医研究已经应用了靶点勾钓方法。例如，转录组学、UHPLC分析和网络药理学已经被用于预测BL02的活性化合物和测试其在非小细胞肺癌中的治疗靶点。本研究通过网络分析发现SFI中有36个活性化合物，生物信息学分析通过CRF基因数据库的维恩图分析进一步鉴定出244个与SFI药效活性密切相关的基因。同时，通路富集和代谢组学分析表明，主要通路信号包括代谢通路和PI3K/Akt通路。通过进一步结合分子对接分析，我们从多个数据库的显著途径富集分析中，筛选出了SFI中几个可以靶向该蛋白的化合物，从而促进了线粒体生物发生进展。初步鉴定的化合物是党参中的菊黄素，该化合物具有最多的可结合的靶蛋白，并与AMPK、SIRT1和Akt具有高亲和力。而生物信息学数据库则推测了菊黄素可能发挥的作用，SFI的一个关键作用是调节线粒体功能，但没有研究显示其药理作用。此外，之前在其他恶性肿瘤中的研究发现，AMPK、SIRT1和Akt在解释线粒体生物发生进展或凋亡细胞死亡时发挥了相对较大的作用。
在我们的研究中，结合多个数据库分析和生物活性分析，我们发现AMPK、SIRT1和Akt蛋白在SFI干预线粒体功能障碍中发挥了关键作用。SIRT1和AMPK这两种调节因子的重要作用已在多项研究中得到证实。由于触发AMPK磷酸化和脂肪酸氧化转录底物，如PGC1α和NRF1, AMPK活性刺激线粒体生物合成，增加肌肉氧化能力。SIRT1有利于PGC1α的去乙酰化和激活，调节MnSOD的活性。AMPK和SIRT1在促进肌肉线粒体生物发生和氧化应激方面具有重叠作用。然而，SIRT1的激活需要AMPK磷酸化，进一步影响PGC1α去乙酰化。由于AMPK/SIRT1的激活与肌线粒体的生物发生和功能密切相关，因此AMPK/SIRT1很可能是防治CRF及其相关代谢作用的关键靶点。我们观察到 SFI 在本次调查中促进了 AMPK 的磷酸化。当 AMPK 被激活时，它会引起 SIRT1 激活，从而导致 PGC1α 活性增加并改善线粒体生物发生。
基于我们研究的另一个主要观察结果，FoxO3a很可能是保护肌肉线粒体生物发生和减少凋亡的骨骼肌细胞的必要物质。FoxO转录因子是forkhead家族转录调控因子的一部分，其中包括FoxO1、FoxO3a、FoxO4和FoxO6。FoxO转录因子参与多种细胞功能的调控，如分化、代谢、凋亡等，尤其是akt介导的抗凋亡特性。此外，FoxO3a被认为是Akt和AMPK信号通路的汇聚点。FoxO3a在Ser413位点的AMPK磷酸化增强了抗氧化应激和线粒体生物发生。另一方面，FoxO3a的活性受到Akt在Ser253位点磷酸化FoxO3a的抑制，从而促进肌肉细胞的抗凋亡。因此，Akt和AMPK信号通路可能受FoxO3a调控，使机体适应生理或病理生理变化。这两种途径的趋同可能是Akt和AMPK途径之间的串扰所必需的。根据我们的数据，SFI的保护作用与PI3K/Akt和AMPK通路介导的FoxO3a的激活有关。我们发现，SFI磷酸化FoxO3a降低了促凋亡蛋白Bax的表达，提高了抗凋亡蛋白Bcl-2的水平，从而减少了肌细胞线粒体功能障碍引起的细胞凋亡。这暗示了PI3K/Akt/FoxO3a和AMPK/FoxO3a在CRF诱导的线粒体功能障碍和凋亡中具有潜在作用。数据揭示了SFI通过Akt/PI3K和AMPK信号通路激活FoxO3a发挥保护作用的新机制。
结论
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